D'après plusieurs notes et illustrations, le chant d'église artistique était lié à la musique instrumentale dans les recueils de cantiques, et ce avant que les jésuites accentuent plus abondamment la composante musicale dans les églises catholiques. L'orgue bénéficia de nouveau de la reconnaissance générale. En de nombreux endroits, nous obtenons des informations sur la fabrication de nouveaux instruments, parmi lesquels le plus fameux est celui se trouvant dans la cathédrale saint Guy à Prague et qui fut achevé par le facteur d'orgues de České Budějovice Jáchym Rudner.
L'orchestre de la cour impériale était la plus grande et la plus importante institution musicale en Bohême. C'est Ferdinand 1er (1526-1564) qui la créa comme un ensemble vocal à deux orgues. Du temps de Maximilian (1564-1576), on y ajouta d'autres instruments et la chapelle atteint le point culminant de son évolution sous Rodolphe II. Peu de noms tchèques y étaient représentés, il s'agissait généralement de Néerlandais, d'Espagnols, d'Allemands et d'Italiens. Pendant 35 ans et jusqu'à sa mort, Philippe de Monte (1521-1603), compositeur de messes, de motets et de madrigaux, en fut le chef d'orchestre. Suivant l'exemple de la cour impériale, la noblesse faisait également, avec ardeur, de la musique dans ses résidences de campagne. Durant la seconde moitié du XVIe siècle, sous le règne des deux derniers souverains de cette famille, Vilém et Petr Vok, c'est avant tout l'orchestre de Rožmberk à Krumlov qui devint la plus célèbre. Au cours des deux premières décennies du XVIIe siècle, Pecka était sans doute le plus grand orchestre au château de Pecka. Il était dirigé par le seigneur Kryštof Harant de Polžice (1564-1621), écrivain, homme de guerre, courtisan et diplomate, qui sacrifia sa vie pour participer au soulèvement tchèque. Parmi ses oeuvres conservées jusqu'à aujourd'hui : le motet à six voix Qui confidunt in Domino (Qui croient en Dieu, 1598), le motet à cinq voix Maria Kron et surtout la magnifique messe à cinq voix sur la mère souffrante Missa Quinis Vocibus super Dolorosi martyr tiré du recueil de madrigaux très apprécié de Luca Marenzio. On trouve encore des fragments conservés de quatre autres oeuvres vocales parmi lesquelles la composition sur les paroles tchèques Dejž tob Pán Bůh štěstí est la plus intéressante.
Le luth était très pratiqué tant en solo que pour accompagner les chants. A Prague, sous Rodolphe II, c'est essentiellement Jan Vencálek qui en était le maître. Comme le prouve, par exemple, la transcription du lied allemand de Regnart, vraisemblablement chanté dans son adaptation tchèque, les compositions vocales étaient adaptées pour le luth.
Nous connaissons la mélodie de quelques chants profanes tchèques populaires du XVe siècle, mais plus encore toutefois du XVIe siècle, comme, par exemple, Čížku, ptáčku zeleného peří, Proč kalina v struze stojí, Stojí lipka v širém poli, Doma chodí po louce, etc. Le plus souvent, elles ont été conservées comme des mélodies de chants spirituels, parfois aussi elles ont gardé la forme qui était la leur quand elles sont devenues le canto firmo des compositions contrapuntiques.
Compositeurs importants
Philippe de Monte (1521-1603)
Jacobus Gallus (1550-1591)
Kryštof Harant de Polžice (1564-1621)
Jan Vencálek (1598-?)