Der künstliche Kirchengesang war einigen Anmerkungen und Abbildungen in den Gesangbüchern zufolge mit Instrumentalmusik verbunden; später haben die Jesuiten in den katholischen Kirchen die instrumentalen Bestandteile ausgiebig verstärkt. Erneut wurde der Orgel allgemeine Aufmerksamkeit zuteil. Wir hören an vielen Orten vom Bau neuer Instrumente, von denen das ruhmreichste im St. Veitsdom in Prag zu finden war, fertig gestellt im Jahr 1567 durch den Budweiser Orgelbauer Jáchym Rudner.
Die größte und wichtigste tschechische Musikinstitution war die Hofkapelle. Gegründet hat sie Ferdinand I. (1526-1564) als Sängerchor mit zwei Orgelspielern. Zu Zeiten Maximilians (1564-1576) wurde die Hofkapelle um einige Instrumentalisten erweitert und erlebte ihre Hochphase unter Rudolf II. Nur wenige tschechische Namen waren hier vertreten, meist handelte es sich um Niederländer, Spanier, Deutsche und Italiener. Für 35 Jahre bis zu seinem Tod war Phillipe de Monte (1521-1603) Kapellmeister. Er komponierte Messen, Motetten und Madrigalgesänge. Nach dem Vorbild des Kaiserhofes förderte auch der Adel auf seinen Landgütern eifrig die Musik. In der zweiten Hälfte des 16. Jahrhunderts ist namentlich die Kapelle Rosenberg in der Gegend von Český Krumlov (Krumau) unter den beiden letzten Herrschern des gleichnamigen Geschlechts, Wilhelm und Peter, berühmt geworden. In den ersten beiden Jahrzehnten des 17. Jahrhunderts musizierte die wohl größte Kapelle auf der Burg Pecka. Gründer war Christoph Harant Freiherr von Polschitz und Weseritz (1564-1621), Schriftsteller, Kriegsherr, Höfling und Diplomat, der nach der Niederschlagung des Aufstand des böhmischen protestantischen Adels enthauptet wurde. Von seinem Werk erhalten sind das sechsstimmige Motett Qui confidunt in Domino (Die, die an den Herren glauben, 1598), das fünfstimmige Motett Maria Kron und die selten schöne fünfstimmige Messe über die leidende Mutter Missa quinis vocibus super Dolorosi martyr aus dem beliebten Marenzios Madrigalgesang. Außerdem sind noch vier weitere Fragmente von Vokalwerken belegt. Die interessanteste Komposition darunter ist die auf den tschechischen Text bezogene Dejž tobě Pán Bůh štěstí (Der Herr gebe dir Glück). Als Soloinstrument oder zur Begleitung des Gesangs wurde oft die Laute eingesetzt. In Prag unter Rudolfs Herrschaft gehörte namentlich Jan Vencálek zu den Meistern. Für die Laute wurden auch Vokalwerke geschrieben, wie zum Beispiel die Transkription des deutschen Liedes von Regnart zeigt, das wahrscheinlich als tschechische Version gesungen wurde.
Bereist im 15., zum größeren Teil jedoch im 16. Jahrhundert, sind Melodien einiger tschechischer weltlicher Volkslieder bekannt. Als Beispiel können die Lieder Čížku, ptáčku zeleného peří (Zeisig, du Vogel grünen Gefieders), Proč kalina v struze stojí (Warum die Schießbeere in einer Rinne steht) , Stojí lípa v širém poli (Eine Linde steht auf offenem Feld), Dorna chodí po louce (Dorna geht übe die Wiese) gelten. Sie blieben zumeist als Melodie des geistlichen Liedes erhalten, manchmal auch in einer Form, in der sie zum Cantus firmus kontrapunktischer Werke wurden.
Wichtige Komponisten
Philippe de Monte (1521-1603)
Jacobus Gallus (1550-1591)
Christoph Harant Freiherr von Polschitz und Weseritz (1564-1621)
Jan Vencálek (1598-?)